細(xì)數(shù)流式細(xì)胞儀驗證的基本流程

1．流式細(xì)胞儀介紹

流式細(xì)胞儀(Flowcytometry)是對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒同時利用檢測器進(jìn)行多參數(shù)、快速的自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍的細(xì)胞亞群從中分選出來。 但流式細(xì)胞儀的細(xì)節(jié)分辨率為零，即它只能測量一種細(xì)胞的總核酸量，總蛋白量等指標(biāo)，而不能鑒別和測出某一特定部位的核酸或蛋白的具體數(shù)目。流式細(xì)胞儀主要由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、分析系統(tǒng)四部分組成。目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)科學(xué)研究、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等研究的各個領(lǐng)域。

2．流式細(xì)胞儀的原理

流式細(xì)胞儀的工作原理為：將經(jīng)特異性熒光染料染色后的待測細(xì)胞放入樣品管中，細(xì)胞在氣體的壓力下進(jìn)入充滿鞘液的流動室，然后鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓柱流束，與水平方向的激光束垂直相交，染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光或產(chǎn)生散射光，這些信號分別被光電倍增管熒光檢測器和光電二極管散射光檢測器接收，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柡螅?jīng)過計算機儲存、計算、分析這些數(shù)字化信息，就可得到細(xì)胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標(biāo)。

3．相關(guān)術(shù)語

設(shè)門：劃定某一區(qū)域的細(xì)胞群體，對其單獨加以分析或分選。

調(diào)補償：若兩種以上的熒光素的發(fā)射光譜之間存在重疊，則需要調(diào)補償。

MFI值：即為平均熒光強度。

4．為什么流式細(xì)胞儀要做驗證呢？

流式細(xì)胞儀是對細(xì)胞或生物顆粒物理、化學(xué)等相關(guān)參數(shù)的自動分析和分選的裝置，對流式細(xì)胞儀進(jìn)行驗證就是保證分析檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，所以必須對所用到的組成系統(tǒng)各部分進(jìn)行驗證，以證明該系統(tǒng)符合檢測的目的和要求，這就是儀器驗證。本質(zhì)上講，儀器驗證就是根據(jù)檢測物質(zhì)的要求，預(yù)先對儀器設(shè)置一定的參數(shù)范圍及合適的檢測器，并通過設(shè)計合理的試驗來驗證該儀器是否符合檢測項目的要求。這些驗證項目如分辨力、線性相關(guān)系數(shù)、重復(fù)性、示值誤差等某一個產(chǎn)生誤差，其他的都會有一定的偏移，致使結(jié)果改變。儀器驗證就是保證整個試驗是否能成功的先決條件，只有經(jīng)過驗證的儀器，確保該儀器各部分都在良好的情況下才能用于細(xì)胞相關(guān)參數(shù)的分析、分選，使檢測結(jié)果得到保證，使誤差降低到最小。

5．流式細(xì)胞儀的驗證項目

（1）  安裝確認(rèn)

a.  文件確認(rèn)

b.  附件確認(rèn)

c.  安裝環(huán)境確認(rèn)

d. 安裝情況確認(rèn)

（2）  運行功能確認(rèn)

a.  運行功能確認(rèn)

b.  軟件控制功能測試

（3） 性能確認(rèn)

a.  分辨力測試

b.   線性相關(guān)系數(shù)測試

c.  檢出限測試

d.  漂移測試

e.  重復(fù)性測試

f.  示值誤差測試

6．流式細(xì)胞儀的操作步驟

(1)  檢測鞘液桶和廢液桶的狀態(tài)是否滿足本次使用，蓋緊黑蓋；

(2)  檢測穩(wěn)壓電源，打開電源，對系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱5-10分鐘；

(3)  打開氣體閾，調(diào)節(jié)壓力，獲得適宜的液流速度，應(yīng)排除管路中氣泡；開啟光源冷卻系統(tǒng)；

(4)  在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；

(5)  利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0和90散射的熒光強度*，并要求變異系數(shù)為最小；

(6)  選定流速、測量細(xì)胞數(shù)、測量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時選擇計算機屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀掌握測量進(jìn)程；

(7)  樣品測量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；

(8)  因為實驗數(shù)據(jù)已存入計算機硬盤（有的機器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大），因此可關(guān)閉氣體、測量裝置，而單獨使用計算機進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；

(9)  最后將所需結(jié)果打印出來，操作完畢，關(guān)機。

7．注意事項

a.   光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，所有需放置在避光的環(huán)境下；另外還要注意磁屏蔽；

b.   光源不得在短時間內(nèi)（一般要1h左右）關(guān)上又打開；使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；

c.   液流系統(tǒng)必需隨時保持液流暢通，避免氣泡堵塞；

d.   鞘流液使用前要經(jīng)過過濾、消毒，必須符合使用要求；

e.   不同的檢測對象選用對應(yīng)的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等；

f.   特別注意的是每次檢測都需要空白對照組，做對照試驗；

g.   調(diào)節(jié)電壓時，如果檢測的目標(biāo)細(xì)胞體積較小，可以適當(dāng)提高電壓值。

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