BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)用于藥品快速無菌快速檢查的評價(jià)研究

上海市食品藥品檢驗(yàn)所，國家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

摘要：目的：評價(jià) BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)用于無菌快速檢查的可行性。方法：選擇 15 種不同類型的無菌制劑，參照 2015 年版中國藥典四部藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，以中國藥典無菌檢查法為參考，考察該方法的專屬性、檢測限、重復(fù)性的及耐用性。結(jié)果：專屬性試驗(yàn)結(jié)果表明該系統(tǒng)適用于部分無菌制劑的無菌檢查，其中，對于丙泊在注射液，該系統(tǒng)的無菌檢查結(jié)果與藥典方法基本相當(dāng)。結(jié)論：BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)用于藥品無菌檢查具有快速、靈敏度高的優(yōu)勢，有望為常規(guī)無菌檢查法帶來有效的補(bǔ)充。

關(guān)鍵詞：無菌檢查；CO2 檢測技術(shù)；快速檢測技術(shù)；BACTEC FX

Keywords: sterility test; CO₂ detection technology; rapid microbiological method (RMM); BACTEC FX

無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器械、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法^[1]。無菌檢查法是最古老和成熟的微生物檢測方法之一。最早可追溯至 1932 年的英國藥典^[2]，我國的第一部藥典（1953 年版）也收載了無菌檢查法。在此之后的藥典改版中，國內(nèi)外藥典對于無菌檢查法進(jìn)行了多次修訂，目前各國藥典^[3-5]基本協(xié)調(diào)統(tǒng)一，均采用培養(yǎng)基渾濁觀察法判斷產(chǎn)品的無菌狀況，培養(yǎng)周期一般不少于 14 天。該方法的適用性較強(qiáng)，但也有一些限制，較長的培養(yǎng)周期難以應(yīng)對重大藥害事件對時(shí)間的緊迫需求；依靠培養(yǎng)基渾濁觀察法受操作人員經(jīng)驗(yàn)影響較大，具有一定的主觀性，而且在整個(gè)檢查過程中需要反復(fù)觀察，操作繁瑣，自動(dòng)化程度低，缺乏一定的可追溯性^[6]。近年來，各國藥典和法規(guī)均鼓勵(lì)新技術(shù)應(yīng)用于微生物領(lǐng)域，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)^[7]、三磷酸腺苷(ATP)發(fā)光檢測技術(shù)^[8]、pH/CO₂ 電阻檢測^[9-11]等，這些快速微生物檢測技術(shù)有效的提升了藥品微生物的檢出效率。

BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)是基于微生物生長原理，培養(yǎng)瓶內(nèi)的各種營養(yǎng)物質(zhì)可提供微生物生長的物質(zhì)基礎(chǔ)，而微生物生長過程中的代謝產(chǎn)物之一 CO₂ 將激活瓶內(nèi)底部熒光感應(yīng)物質(zhì)而發(fā)出熒光，熒光信號變化與 CO₂ 變化成正比。儀器瓶位內(nèi)的探測器探測到該熒光信號的變化并經(jīng)一系列運(yùn)算公式的運(yùn)算，得出熒光信號變化的各種參數(shù)，從而判斷培養(yǎng)瓶內(nèi)是否有微生物生長。該系統(tǒng)目前在臨床領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛^[12]，也有用于無菌樣品的檢測的報(bào)道[13-14]。

本研究選擇了 15 種典型的無菌制劑，參照 2015 年及 2020 年版中國藥典四部通則<9201>藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的有關(guān)內(nèi)容，對 BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)與中國藥典的無菌檢查法進(jìn)行了系統(tǒng)比較。同時(shí)選取特定品種，全面評估 BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)與中國藥典的無菌檢查法在專屬性、檢測限、重復(fù)性以及耐用性是否存在差異。為該品種是否能采用 BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)進(jìn)行無菌快速檢測提供依據(jù)。

1   儀器與材料

1.1  試驗(yàn)儀器

BACTECTM FX40 全自動(dòng)系統(tǒng)（美國，BD 公司）。

1.2  試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26003 、大腸埃希菌 CMCC(B)44102 、銅綠假單胞菌

CMCC(B)10104、生孢梭菌 CMCC(B)64941、枯草芽孢桿菌 CMCC(B)63501、白色念珠菌

CMCC(F)98001、黑曲霉 CMCC(F)98003 均購于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心(CMCC)。

1.3  試驗(yàn)樣品

1.4  試驗(yàn)用試劑及培養(yǎng)基

硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基及胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

BACTECTM Standard/10 Aerobic/F 標(biāo)準(zhǔn)需氧瓶、BACTECTM Lytic/10 Anaerobic/F 含溶血素厭氧瓶及 BACTEC ™ PLUS+ Aerobic/F 樹脂需氧瓶均購于美國 BD 公司。

2        方法

2.1  無菌檢查

藥典組：按照 2015 年版中國藥典四部通則<1101>的規(guī)定，采用薄膜過濾法，接種硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基置于 32.5℃，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置于 22.5℃培養(yǎng) 5d，每天觀察結(jié)果。

BACTEC FX 組（FX 組）：將一定量供試品和<100cfu 試驗(yàn)菌加入標(biāo)準(zhǔn)需氧瓶或厭氧瓶中混勻，直接上機(jī)檢測，溫度設(shè)置 35℃，培養(yǎng)時(shí)間為 5d，機(jī)器自動(dòng)運(yùn)行發(fā)現(xiàn)陽性后判讀并報(bào)警。

比較藥典組和 FX 組的 5d 的生長情況。

2.2 丙泊注射液無菌快速檢查的評價(jià)

2.2.1   專屬性

專屬性試驗(yàn)方法同 2.1，藥典組和 FX 組每種試驗(yàn)菌平行進(jìn)行三次獨(dú)立試驗(yàn)。

2.2.2    檢測限

藥典組和 FX 組的樣品接種方法與專屬性相同，供試品中加入＜2cfu 的試驗(yàn)菌，每種試驗(yàn)菌重復(fù)進(jìn)行 10 次。

2.2.3    重復(fù)性

由不同的實(shí)驗(yàn)人員于不同的實(shí)驗(yàn)時(shí)間，在不同的實(shí)驗(yàn)室，按照專屬性方法取樣和接種， 進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，考察方法的精密度。

2.2.4    耐用性

增加樣品的接種量至 10ml、20ml 或延遲 24 上機(jī)，其他參考專屬性試驗(yàn)不變，考察 FX

組方法的耐用性。

3   結(jié)果

3.1 無菌檢查

15 個(gè)試驗(yàn)樣品的無菌檢查結(jié)果表明，藥典組和 FX 組的促生長能力基本相同，FX 組對 7 株試驗(yàn)菌的促生長能力普遍快于藥典組（表 1 和表 2）；但是仍有 4 個(gè)品種：鹽酸氨溴索注射液、吡諾克辛滴眼液、復(fù)方托吡卡胺滴眼液和氟米龍滴眼液出現(xiàn)“假陰性"的結(jié)果。將接種量由 4ml 減少至 1ml，鹽酸氨溴索注射液能在規(guī)定時(shí)間內(nèi)報(bào)告陽性，而其余 3 種滴眼液仍未能消除“假陰性"（表 3）。進(jìn)一步采用帶中和效果的樹脂瓶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，恢復(fù) 4ml 的接種量，四種樣品均在規(guī)定時(shí)間給出陽性結(jié)果（表 3）。

表 1 FX 組檢出時(shí)間(d/h/min)

Tab.1 Detection time of FX group(d/h/min)

注：“-"表示培養(yǎng) 5 天仍未報(bào)陽性結(jié)果。

Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days.

表 2  藥典組檢出時(shí)間(d)

Tab.2 Detection time of pharmacopoeia group(d)

注：“-"表示培養(yǎng) 5 天仍未報(bào)陽性結(jié)果。

Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days

表 3 FX 組減少接種量或采用樹脂瓶檢出時(shí)間(d/h/min)

Tab.3 Detection time of FX group after reducing inoculation volume or changing to BACTEC ™ PLUS+ Aerobic/F medium(d/h/min)

注：“-"表示培養(yǎng) 5 天仍未報(bào)陽性結(jié)果，“/"表示未進(jìn)行試驗(yàn)。

Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days,"/" means no t tested.

3.3 丙泊注射液無菌快速檢查的評價(jià)

3.3.1   專屬性試驗(yàn)結(jié)果 按照 2015 年版中國藥典無菌檢查的規(guī)定，丙泊在注射液在藥典組和 FX 組的添加的 7 株菌在 5 天內(nèi)均能正常生長，2 種方法的專屬性不存在差異。

3.3.2   檢測限試驗(yàn)結(jié)果  采用 SPSSV13.0 fisher 確切概率法，對上述 7 株試驗(yàn)菌的檢測限試驗(yàn)結(jié)果分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表 4）， 2 種方法的檢測限差異無顯著性差異。

表 4 丙泊注射液檢測限試驗(yàn)結(jié)果

Tab.3 Results of detection limit of propofol injection.

注：“-"表示培養(yǎng) 5 天仍未報(bào)陽性結(jié)果。

Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days

  重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果  在 5d 內(nèi)，2 種方法的 7 株試驗(yàn)菌均正常生長， FX 組的重復(fù)性與藥典組相當(dāng)。

4   討論

  本研究選擇了無菌制劑的代表劑型，包括注射劑和滴眼劑等，涵蓋了液體制劑和固體制劑，規(guī)格不等，選擇的樣品數(shù)量較多，同時(shí)，增加了銅綠假單胞菌作為試驗(yàn)菌株，未見同類報(bào)道。由于 BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)的檢驗(yàn)原理與直接檢查法基本相同，因此選擇的樣品大多為無抑菌性的樣品。試驗(yàn)結(jié)果表明，BACTEC FX 系統(tǒng)并非適用于所有品種。以滴眼劑為例，3 種多劑量的滴眼液出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而一次性使用的滴眼液未見異常，推測可能是多劑量的滴眼液中的防腐劑對結(jié)果造成了干擾。由于 BACTECFX 系統(tǒng)采用的是直接接種法，全組份均在培養(yǎng)基中，而藥典方法為薄膜過濾法，推測原輔料被濾過，對結(jié)果影響較小。

  為了消除樣品中可能存在的抑菌成分的影響，我們選擇了具有特殊吸附性的樹脂需氧瓶，該培養(yǎng)瓶由“帶正電荷樹脂"和“多價(jià)吸附樹脂"組成，可全面吸附多種抑菌成分，樹脂孔徑也為微生物的生長提供了附著表面，更有利于微生物生長。可以在不改變接種量的基礎(chǔ)上，獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。采用標(biāo)準(zhǔn)需氧瓶結(jié)果為陰性的 4 個(gè)樣品在采用樹脂瓶后，結(jié)果均為陽性。同時(shí)，我們也采用樹脂瓶對注射用硫酸多黏菌素 B 進(jìn)行了人工污染實(shí)驗(yàn)（結(jié)果未列出），除添加大腸埃希氏菌的培養(yǎng)瓶未能正常生長以外，其余 6  株菌均正常生長，提示樹脂瓶無法*中和此類抗生素的抑菌性。脂肪乳類無菌產(chǎn)品一直是無菌檢查中的一類難點(diǎn)，由于樣品本身的渾濁特性，在采用常規(guī)藥典方法進(jìn)行無菌檢查時(shí)，供試品管易顯渾濁，通常需要在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)到期后進(jìn) 行二次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)進(jìn)行確認(rèn)，這一操作不僅增加了污染的風(fēng)險(xiǎn)而且增加了無菌檢驗(yàn)周期（大于 14 天）。而采用自動(dòng)化的檢測系統(tǒng)可以克服這一缺陷。系統(tǒng)自動(dòng)化采集生長信號，區(qū)別于傳統(tǒng)無菌檢查的繁瑣操作、靜態(tài)培養(yǎng)以及人為的濁度判讀法，降低了無菌操作的風(fēng)險(xiǎn)， 具有結(jié)果報(bào)告的實(shí)時(shí)性、可追溯性以及避免人為干擾的優(yōu)勢。本研究從專屬性、檢測限、重復(fù)性、耐用性 4 個(gè)方面對丙泊注射液無菌快速檢查方法和藥典方法進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，快速方法與藥典方法基本相當(dāng)。采用 BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)能有效縮短產(chǎn)品陽性檢出時(shí)間。當(dāng)然，該系統(tǒng)也有一定的局限性，如樣品的接種量有限。在本研究中，我們適當(dāng)?shù)脑黾恿藰悠返慕臃N體積，均能準(zhǔn)確的給出陽性結(jié)果。對于體積較大的注射液，可通過增加接種培養(yǎng)瓶的數(shù)量以滿足檢驗(yàn)要求。另外，本研究的試驗(yàn)不可能覆蓋所有的微生物，不能排除對于某些微生物的促生長能力 2 種方法可能不相同。在下一步研究中，需要增加試驗(yàn)菌株的種類，特別是產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)境微生物的考察。

   綜上，選擇 BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)的作為藥品無菌快速檢查方法時(shí)，首先應(yīng)考察樣品的特性，其次根據(jù)快速檢測方法及樣品的特點(diǎn)增加相應(yīng)的菌株進(jìn)行全面的評價(jià)。應(yīng)用BACTEC FX 全自動(dòng)系統(tǒng)作為無菌快速檢測方法，可為常規(guī)無菌檢查法帶來有效的補(bǔ)充。

參考文獻(xiàn)

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注：摘引上海藥檢所文章關(guān)于FX40在快速無菌領(lǐng)域的應(yīng)用。

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